Bioenergetika di Membran

Mata Kuliah : Fisiologi Prokariot

Bioenergetika di Membran

Proses bioenergetika di membran memanfaatkan aliran elektron (kemiosmosis), sesuai dengan teori kemiosmotik yang dikemukakan oleh Peter Mitchell. Proton ditransfer keluar sel kemudian terjadi potensial membran, proton kembali ke dalam sel (gradien konsentrasi menurun) sehingga kerja dapat dilakukan. Proton akan kembali melalui translokator proton (ATP sintase) hal itu dapat dibuktikan dengan menggunakan DCCD (N,N’– disiklohesil karbodiimide) inhibitor ATP sintase. Adapun kerja yang dilakukan diantaranya transpor, rotasi flagela, sintesis ATP, pengeluaran ion sodium, dll.

Bakteri mentranslokasi proton melewati membran dengan energi (kimia dan listrik) yang dikonservasi pada gradien proton. Jumlah perubahan energi listrik dan energi kimia disebut energi elektrokimia. Kerja elektrokimia merupakan fungsi dari potensial membranD Y dan perbedaan konsentrasi antara larutan yang dipisahkan oleh membran. Potensial membran: DY= Y_in - Y_out (volt), DY = (-) bila permukaan dalam membran bermuatan (-). Komponen Kimia [ DmH⁺ ] berfungsi mengubah energi kimia ke energi listrik untuk mendapatkan ekspresi dari energi elektrokimia [DmH+].

Ionofor adalah komponen organik yang membentuk kompleks dengan kation dan bersifat larut di lipid dan mudah melewati membran. Valinomisin berperan dalam transport K⁺ dan Rb⁺. Valinomisin dengan K⁺ akan menjalani transpor elektrogenik membentuk potensial membran. Bila valinomisin diberikan pada sel yang memiliki konsentrasi K⁺ yang tinggi, K⁺ akan cepat keluar terjadi potensial membran sementara. Bila K⁺ ekstraseluler yang berlebih dengan valinomisin maka K⁺ berdifusi ke dalam sel sehingga potensial membran hilang. Nigerisin berfungsi membawa K⁺ pengganti H⁺. Bila nigerisin dimasukkan ke dalam sel maka gradien pH hilang, potensial membran tidak menurun. Gramisidin, menjalani transpor elektrogenik H⁺ > Rb⁺, K⁺, Na⁺ kemudian erjadi equilibrasi proton melewati membran sel yang merusak DY dan DpH. Dinitrofenol, membuat influx H⁺ dan R^- ke dalam sel dan kembali ke luar sel tanpa H⁺, merusak DpH dan DY, uncoupler bagi fosforilasi oksidatif.

Memompa proton ke luar sel membutuhkan energi. Energi di dapat melaui reaksi eksergonik yaitu elektron berpindah ke potensial yang lebih tinggi dengan menggabungkan reaksi redoks dengan transpor proton. Selanjutnya respirasi bergabung dengan eflux ion Na⁺, terjadi pada beberapa halofil yang membutuhkan konsentrasi yang tinggi dari Na⁺. Misalnya Vibrio alginolyticum membuat DmNa⁺ melalui 2 cara: pada pH 6,5 dan 8,5. Ketiga, dapat melaui hidrolisis ATP pada bakteri yang melakukan fermentasi dan dikatalisis oleh proton terjadi translokasi dengan bantuan ATP-Synthase terikat membran. Mekanisme lain untuk menghasilkan DY atau Dp yaitu dengan dekarboksilasi transport sodium, bakteriorhodopsin merupakan pembentuk Dp dan halorhodopsin yang merupakan pompa cl yang dipicu cahaya pada halofil sehingga mengakumulasi Cl^- intraseluler untuk menjaga kestabilan osmotik.

Bioenergetika di Sitosol

Energi elektrokimia merupakan jenis energi yang memicu reaksi seluler yang disebabkan oleh gradien proto. Dalam bentuk molekul energi kimia memiliki energi yang tinggi, terjadi dalam membrane sel. Adapun fungsi dari molekul berenergi tinggi yaitu memicu biosintesis asam nukleat, protein, lipid, dan polisakarida di sitoplasmada berperan dalam pengambilan molekul ke dalam sel. Molekul berenergi tinggi mempunyai energi bebas yang tinggi dari hidrolisis ( ³ 2900 J),dan mempunyai potensial yang tinggi untuk mentransfer suatu grup molekul ke molekul akseptor. Grup yang umum ditransfer antar molekul adalah grup fosforil.

ATP dapat bertindak sebagai donor, misalnya AMP berperan dalam sintesis protein, ADP merpran dalam pembentukan polisakarida dan pirofosfat memproduksi ensim. Sedangkan PEP lebih energetik sebagai donor fosforil bila dibandingkan dengan ATP.

Grup asil adalah derivat dari asam karboksilat. Ensim yang didonorkan oleh grup asil yaitu transasilase pada sintesa lemak dan protein. CoA mendonorkan CoA transferase pada reaksi fermentasi dan fosfat menghasilkan ensim kinasE pada saat pembentukan ATP dari ADP. ATP memiliki peranan dalam membentuk ikatan amida, tioester dan ester. ATP disintesis di membran dengan fosfolirasi ADP dilanjutkan dengan fosfolrasi transpor elektron. ATP juga di sintesin di sitosol melalui fosfolirasi ADP dilanjutkan dengan fosfolirasi tingkat substrat.

TRANSFER ELEKTRON

Energi untuk proses fisiologi (biosintesis dan transpor solut) dihasilkan melalui proses penggabungan aliran elektron pada membran untuk menghasilkan gradien proton. Pembawa elektron berupa satu seri protein pembawa elektron dan lipid (quinone) yang dinamakan aliran elektron. Setiap pembawa elektron mempunyai potensial elektroda yang berbeda serta mentransfer elektron ke pembawa dengan potensial yang lebih tinggi.

Pada reaksi aerobik yang menjadi penerima elektron terakhir adalah oksigen sedankan pada annaerob adalah nitrat, sulfat atau fumarat, dll. Pembawa elktron dapat berupa protein (flavoprotein, protein FeS, sitokrom) dan lipid (quinone), yang terdapat di ensim multi protein kompleks yang disebut oksidoreduktase. Elektronnya dibawa oleh grup prostetik (molekul non protein yang terikat pada protein).

Grup prostetik flavoprotein adalah flavin (Fp, FAD, FMN), membawa elektron dan hidrogen. Flavin berupa vitamin riboflavin (vit B2) dan ada dua jenis yaitu Flavin mononukleotida (FMN) dan Flavin adenindinukleotida (FAD). Semua flavoprotein mempunyai FMN atau FAD → oksidasi yang dikatalisis dan potensial redoks berbeda. Quinone adalah lipid pembawa elektron dan hidrogen dari dan ke kompleks protein pembawa elektron yang tidak mobil. Bakteri mempunyai 2 tipe quinone yaitu Ubiquinone (UQ) di mitokondria, menaquinone MQ/MK pada derivat vit K.

Protein Besi Sulfur, grup prostetiknya klaster besi-sulfid/FeS atau Fe/S. Sulfur → lebih asam → pH turun 1 akan dihasilkan H₂S. Sitokrom adalah pembawa 1 elektron. Grup prostetiknya heme. Heme merupakan 4 cincin pirol dengan jembatan methene disebut tetrapirol. Di pusat heme ada atom besi yang terikat pada nitrogen di cincin pirol. Ada 4 sitokrom yaitu Cyt a, b, c, d dengan 4 heme (a, b, c, d).

~ Organisasi Pembawa Elektron Pada Bakteri

Rantai elektron antar bakteri berbeda tergantung kondisi pertumbuhan, kompleks dehidrogenase dan kompleks oksidase dihubungkan oleh Quinone. Bakteri mensintesis dan mensubstitusi kompleks dehidrogenase tergantung sumber elektron dan akseptor elektron. Perbedaan utama rantai transpor elektron pada bakteri dan mitokondria yaitu jalur menuju akseptor elektron terminal pada bakteri bercabang di quinone atau Cyt, Banyak bakteri dapat merubah rantai transpor elektron tergantung kondisi pertumbuhan.

Situs penghubungan adalah situs pada jalur transpor elektron dimana reaksi redoks digabung dengan translokasi proton dan terbentuk Dp. setiap situs penggabungan dilanjutkan dengan situs sintesis ATP.

Potensial Proton dapat dihasilkan melalui Loop Q atau siklus Q dan pompa proton. Karakter Loop Q, pembawa elektronnya bergantung antara yang membawa hidrogen dan elektron (flavoprotein dan quinone) dengan yang hanya membawa elektron (FeS dan Cyt). Flavoprotein dan protein FeS terdiri dari NADH dehidrogenase (dapat berupa situs penggabungan). Sedangkan siklus Q, terjadi pada kompleks bc₁. Pada bakteri kompleks bc₁ terdiri dari 3 polipeptida. Pompa proton mengkatalisa translokasi proton bukan elektron melalui membran.

Transpor elektron pada E. coli

E. coli adalah bakteri Gram - heterotrofik fakultatif anaerob → aerob, anaerob, fermentasi. Pada kondisi Aerob dibuat 2 macam kompleks sitokrom oksidase: Cyt bd (Cyt d) → ke oksigen e^- → UQ → oksidase terminal Oksidasenya : ubiquinol oksidase afinitas tinggi terhadap O₂. Cyt bo (Cyt o) → ke oksigen berupa pompa proton predominan bila tingkat O₂ tinggi. Ada 4 polipeptida yang berasosiasi. Polipeptidanya mengandung 2 atom Cu, 2 heme tipe b. Sedangkan kondisi annaerob hanya terjadi bila tak ada oksigen, oksigen menekan sintesis nitrat dan fumarat reduktase.

Transpor Elektron Pada Paracoccus denitrificans

Merupakan bakteri Gram - non fermentasi → respirasi aerobik atau nitrat. Pada kondisi aerob, selain Cyt o, masih memiliki kompleks bc₁, Cyt aa3 oksidase . P. denitrificans mempunyai 3 situs penggabungan: NADH dehidrogenase (NADH-ubiquinone oxidoreductase), Kompleks bc₁, dan Cyt aa₃ oksidase. Pada annaerob ada dua situs penggabungan yaitu NADH dehidrogenase dan Kompleks bc₁ .

Transpor Elektron Pada Wolinella succinogenes. Respirasi fumarat banyak terdapat pada bakteri yang tumbuh anaerob. W. succinogenes = gram ( - ), anaerob, dapat hidup dengan H₂ atau format.

Rantai transpor elektron terdiri dari ensim periplasmik yang mengoksidasi donor elektron, menaquinone terikat membran (MQ) = pembawa elektron intermediate, dan Fumarat reduktase terikat membran = menerima elektron dari MQ dan mereduksi fumarat (di situs sitoplasmik). Kompleks reduktase fumarat mengandung 3 subunit : Flavoprotein dengan FAD sebagai grup prostetiknya, mempunyai beberapa pusat FeS, mempunyai 2 heme tipe b yang mengikat fumarat reduktase ke membran

iseng^_^

"labirin"

labirin ini semakin menjadi-jadi..

hingga detik ini aku tak kunjung menemukan pintu keluar itu..

dimana?..disebelah mana?

semua yang kulihat hanya gelap...

dinding2 ini terasa semakin bertambah tinggi...

berulang-ulang aku kembali ke tempat ini,

padahal aku yakin sebelumnya aku sudah pernah kesini..

kuraba-raba dinding labirin ini..kemudian aku berlari mejauhi kegelapan..

namun ditempat aku berhenti pun semua terlihat sama...

apa ini?

aku ingin keluar.....

aku ingin melihat sedikit cahaya..sedikit saja...

catatan mahasiswi labil 3

Sepi ini bukan tanpa asalan……..perasaan seperti ini seperti sudah terakumulasi dalam hati dalam waktu yang sudah sangat lama…

Malam ini aku merasa sangat kesepian, bukan karena dia berada di tempat yang jauh, tapi karena komunikasi kita yang ga lancar dari kemaren.. jarak yang memisahkan ini sudah cukup terbiasa bagi ku…..sulit! sangat sulit!

Yah..beginilah,,resiko berpacaran jarak jauh itu memang sangat besar…bahkan aku pernah merasakan hal paling menyakitkan yang tak pernah kusangka itu akan aku alami, dan aku tak menyangka dia tega melakukan itu padaku..”selingkuh” itu lah yang sudah dia lakukan ± 6 bulan yang lalu. Bodohnya aku, aku masih memaafkan dia, dan masih menginginkan dia untuk kembali padaku………..akkkh..aku tak tau,,apakah keputusan yang aku ambil itu benar atau salah. Yang pasti sekarang aku merasa kalo dulu aku sangat bodoh!...mungkinkah Karena aku terlalu cinta dia? Cinta yang menbutakan aku dan membuat aku tak bisa mengambil keputusan yang masuk akal?

Haruskah sekarang aku menyalahkan cinta? Sementara aku tak bisa bohongi diriku sendiri bagaimana besarnya perasaanku padanya…

Meskipun kejadian itu sudah berlalu 6 bulan, namun sekarang aku merasakan kekhawatiran yang teramat sangat saat sebentar lagi dia akan kembali ke kota itu, dan pasti disana dia akan bertemu dengan mantan selingkuhannya itu. Apa yang terjadi nanti Tuhan,, aku serahkan semuanya pada Mu, hanya padaMu,,, karena aku pun sudah merasa lelah untuk terus mengingatkan dia, semoga dia benar2 bersikap dewasa kali ini.karena aku sudah berjanji pada diriku sendiri, dan pada orang2 terdekatku, jika dia melakukan kesalahan yang sama [lagi], aku akan benar2 pergi meninggalkan dia..selamanya.

Terkadang aku ingin dia masih berada di jawa dalam waktu yang sangat lama…haha..biar dia ga ke kota itu, tapi aku tau aku tak bisa melawan takdirNya…jadi kuserahkan semuanya hanya pada Mu Ya Allah….

Ini lah yang aku rasakan saat ini…26 Mei 2011.

ORGANOGENESIS

Pendahuluan

Prosedur in vitro digunakan untuk tingkat tertentu di hampir setiap sayuran utama agronomi, dan berbagai jenis serat. Keberhasilan teknologi tersebut membutuhkan cara yang efisien untuk regenerasi tanaman dari organ terisolasi, jaringan, dan sel. Semangka, Citrullus lanatus, adalah tanaman penting yang kurang mendapat perhatian dibandingkan dengan mentimun. Metode budidaya yang diterapkan untuk semangka juga masih sedikit.

Kultur jaringan merupakan metode yang menjanjikan untuk digunakan dalam pemuliaan semangka. Sel baru yang dihasilkan dari penelitian kultur jaringan telah menghasilkan system regenerasi tanaman yang efisien untuk semangka (Compton dan Gray, 1993; Dong dan Jia, 1991; Srivastava et al, 1989.). Kultur jaringan pada semangka menggunakan kotiledon bibit sebagai sumber eksplan, dari tunas adventif yang dapat diperoleh dengan proses organogenesis. Tunas kemudian berakar dan membentuk tanaman baru dalam waktu 6 samapai 8 minggu dari proses inisiasi. Metode ini dapat digunakan untuk mendapatkan tanaman transgenik dan tetraploid, yang dapat digunakan untuk meningkatkan perkembangbiakan kultivar semangka triploid (Compton dan Gray, 1994). Teknik mikropropagasi semangka triploid dan tetraploid dari meristem telah diketahui selama bertahun-tahun (Xu et al 1979;. Anghel dan Rosu 1985). Barnes (1979) mengembangkan tiga tahap dalam system propagasi invitro untuk semangka diploid juga berlaku untuk semangka triploid (tanpa biji) dengan transplantasi semangka. Compton et al., 1993 menunjukkan sebuah metode sederhana untuk mikropropagasi semangka diploid dan tetraploid menggunakan eksplan tunas-tip. Tujuan dari metode terbaru ini adalah mendirikan system budidaya tanaman regenerasi dari eksplan yang berbeda (menembak tip dan stek nodal) dari kultivar diploid dan tetraploid dari semangka lokal dan eksotis.

catatan mahasiswi labil 2

10 maret 2011

Ku hanya ingin kau mengerti……….

Aku mohon jangan anggap remeh perkataan ku ini…

Jika kau tau, Hari ini aku sngt takut,,tkut bnr2 akn khilngan mu..tkut bnar2 kau melakukannya lagi…

Seketika Seluruh bdan ini lemas saat mendengar berita itu…tp akhirnya aku lega karna knyataanya itu semua tak bnar…

Kau pstii tauu bgaimana paniknya akuu…

Tolong….kapanpun itu dan dimanapun kamu berada tolong jaga keutuhan cinta ini..

Jangan sampai hubungan ini berakhir krn hal yg sbnrnya dapt kita dihindariii sebelumnya…..

Semntara aku disni hanya bisa pasrah, berserah pada takdir….

catatan mahasiswi labil

Ga suka deh kalo kaya gini

Ngerasa uda ga ada yg bisa diomongin lagi sma dia

Pasti dia juga ngerasa yang sama…………

Bosan kah aku?

Bosankah dia?

Ah ini hanyalah masalah kecil dari beribu masalah yang sudah kuhadapi dengannya

Mungkin memang harus seperti ini

Aku percaya semua ada waktunya

Dan kejenuhan juga pasti akan akan datang tanpa direncanakan

Tapi setelah ini keceriaan pasti akan hadir kembali

Sudahlah jangan jadikan ini sbgai mslh…

Aku harus bisa merubah diriku

Sikap ku dan semua yang dapat menghancurkan semuanya

Jika aku masih ingin dengannya, aku harus bisa menyesuaikan diri dengannya

Haruskah sekarang aku menyalahkan semuanya?

Setelah semua yang sudah kulalui dan dengannya?

Haha..=D

Jauh sebelum semua dimulai mungkin aku memang sudah salah memilih jalan ini

Namun aku hanya mengikuti kmna kata hati ini mengantarkanku sehingga akhirnya aku kembali padanya

Semua hati punya cerita yang terkadang tak dapat dijelaskan dengan kata-kata dan akal fikiran

Hanya hati yang peka yang dapat memahami arti dari semua yang terjadi sesungguhnya

Menjalani hidup dalam ketakutan bayang2 ketidakpastian yang pasti akan menghancurkan hidupku

Suatu saat nanti…

Ingin sekali ku hentikan drama ini dalam suatu ikatan suci yang masih sangat jauh untuk bsa dicapai pada saat ini

Tapi……….

…

Aku tak berani berfikir apa yang akan terjadi nanti

Semua terasa begitu berat

Aku tak tau akan sampai kapan aku begini dengannya

Hhhuft

Cinta macam apa ini?

Akan adakah orang yang masih akan mendukungku jika mereka semua tau apa yang sebenarnya terjadi?

Sepertinya tidak

Haha..=D

Cinta yang tak pernah ada

Sedikit rasa itu selalu muncul tiba-tiba

Perlahan merasuki bagian kelam dalam diri ini

Rasa yg tak pernah hilang meski semua telah berubah

Ragu..takut..

Jujur, Aku memang takut kehilangn dia..

Namun, semuany telah trlnjur trjdi

Dan tak ada gunanya menyesal saat ini

Kesalahan yang tak bisa ku hindari ini

Menjadi sebuah ancaman bersar dlm hidupku..

Semua mungkin terlihat sempurna..

Namun apa yg terjadi didlm hnya kita yg tahu

Terkadang aku ragu dengn perasaan mu yg sebenarnya pada ku

Namun semoga itu hnya perasaan ku sja..

Ataukah mungkin dihatimu sebenarnya tak pernah ada cinta untukku..?

Ceritakanlah padaku apa yg sebenarnya kau rasa

Aku tak ingin menjadi sesuatu yg kelak akan kau sesalkan

Aku hnyalah aku

hnyalh seorang perempuan yang rapuh

dan tk memiliki apapun yang bisa dibanggakan

namun meski begtu aku tetap mengharapkan kejujuran mu

meski harus sakit sendiri disni..

(devi lia wati)

ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSA

Nama : Devi Lia Wati

NRP : G34080061

Kelompok : 8

ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSA

Tujuan : Mengetahui dan melakukan isolasi fagmen DNA dari gel agarosa

Pendahuluan

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Teknik elusi atau disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis merupakan tekni isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan misalnya dalam sebuah penelitian dikatakan teknik ini digunakan untuk mengisolasi protein spesifik dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006).

Analisis fragmen DNA secara tidak langsung mendeteksi perbedaan tertentu dalam urutan nukleotida molekul-molekul DNA. Dalam percobaan ini menggunakan elektroforesis gel untuk memilah bedasarkan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari molekul yang panjang dengan suatu enzim restriksi. Campuran DNA dengan enzim restriksi akan menghasilkan pita yang khas, yang menunjukkan molekul awal DNA dan enzim yang digunakan. Molekul DNA plasmid yang relatif kecil dapat diidentifikasi hanya bedasarkan fragmen-restriksi (Campbell 2002).

Metode

Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang sesuai dengan yang diinginkan, pemotongan dilakukan di atas transilluminator UV. Potongan gel dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dipotong–potong atau dicacah. Buat corong yang terbuat dari bagian eppendorf yang dasarnya telah dilubangi dan kemudian dilapisi membran nylon hybond untuk menyaring gel. Membran nylon dibasahi dengan 50 ul larutan penyangga elusi. Hasil cacahan gel dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran nylon hybond. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan melalui membran. Eppendorf disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4°C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu diekstraksi cairannya dengan PCI sebanyak 1x volume supernatan. Larutan divorteks selama 1 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. supernatan (fase atas dari hasil sentrifugasi) diambil, lalu larutan diendapkan dengan menambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M, pH 5 dan 2‐3 volume etanol absolut). Pelet yang dihasilkan dibilas dengan etanol 70% lalu dikeringkan dengan vakum. Endapan disuspensikan dengan menambahkan 15 – 20 ul dH20.

Hasil Pengamatan

Elusi atas

Elusi bawah

Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan setelah dilakukan running pada elektroforesis pada fragmen DNA maka didapatkan data berupa gambar, hasil yang diperoleh menunjukkan semua kelompok hampir tidak mendapatkan hasil DNA, kecuali satu kelompok yang terdapat pita. Pita DNA itu terlihat tipis. Hal tersebut mungkin disebabkan kontaminasi akibat dari kurang sterilnya saat pengerjaan atau praktikan kurang teliti dalam melakukan rangkaian percobaan sehingga DNA plasmid tertinggal dan tidak terambil. Selain itu juga dapat disebabkan terlalu banyaknya gel yang terpotong ataupun banyak DNA dari vektor yang rusak akibat terlalu lama terkena sinar UV keika akan dipotong. Hal ini dapat diatasi dengan meminimalkan waktu pemotongan di atas transuliminator dan juga kuantitas gel dikurangi agar ketika dielusi dengan bufer, banyak dari gen yang ikut terelusi.

Keberadaan plasmid DNA dilihat dari sumur-sumur gel yang menghasilkan pita pada saat running. Kegunaan larutan penyangga atau buffer elusi adalah untuk melicinkan DNA saat di saring pada tabung ependorf, penambahan etanol Na asetat bermuatan positif berfungsi untuk mengikat molekul DNA yang bermuatan negatif. Setelah diikat dengan etanol dilakukan inkubasi dan sentrifuse untuk memisahkan larutan dengan DNA. Etanol absolute berfungsi untuk mengendapkan DNA.

Fragmen DNA yang diisolasi dengan teknik ini dalam praktikum yang dilakukan yaitu fragmen DNA yang didapat dari hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi pada praktikum sebelumnya. Senyawa yang digunakan dalam praktikum ini yaitu berupa larutan penyangga elusi yang terdiri dari Tris pH 7.5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), H2O atau TE. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al 1995). SDS merupakan suatu detergen fungsinya yaitu membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991). Membran nylon hybond untuk menyaring gel.

Simpulan

Percobaan ini dapat dikatakan kurang berhasil karena sebagian besar kelompok tidak memperoleh pita DNA setelah dilakukan running. Kesalahan tersebut diakibatkan oleh praktikan yang kurang teliti dalam melakukan tahapan-tahapan percobaan yang mana dituntut bekerja dengan ketelitian tinggi serta steril. Karena bekerja dengan sesuatu yang berukuran mikro.

Daftar Pustaka

Brown, T.A. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.

Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Fitriyah Juliani. 2006. Isolasi protein spesifik intestine cacing Mecistocirrus digitatus dewasa dengan teknik elusi. [Skripsi]. Surabaya: UNAIR Press

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books.

PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

Nama : Devi Lia Wati

NRP : G34080061

Kelompok : 8

PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

Tujuan : mengetahui dan melakukan pemotongan DNA dengan enzin Restriksi

Pendahuluan

Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda.

Enzim restriksi endonuklease mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme (Sambrook 1989).

Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda. Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca dengan arah yang sama. Sekuen ini disebut palindromik. Berdasarkan ujung hasil pemotongannya, enzim restriksi dapat memotong dengan ujung lengket/lancip (sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end). Enzim yang memotong pada kedua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI. Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI,MspI dan lain-lain (Stansfield 2003)

Metode

Sampel

Inkubasi 37^oC (overnight)

Elektroforesis (gel agarose)

Hasil

Pembahasan

Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends ataucohesive ends (Tjahjoleksono 2009).

Setelah dilakukan restriksi untuk memotong gen dan vektor agar mempunyai ujung yang spesifik, dilakukanlah elektroforesis agar gen atau vektor yang diperoleh dapat diisolasi yang akan digunakan dalam proses ligasi. Gambar 1 adalah hasil dari elektroforesis proses restriksi yang nantinya pita tersebut akan dipotong untuk isolasi fragmen. Berdasarkan hasil yang di dapat terlihat ada dua pita yang terbentuk, satu pita berada diatas dan satu pita berada di bawah. Pita yang beada diatas disebut vector karena ukurannya lebih besar dan yang di bawah disebut insert, hal itu terjadi karena adanya perbedaan berat diantara vektor dan insert. Namun dalam foto terlihat ada beberapa sumur yang hanya memiliki satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan teknis yang dilakukan praktikan. Hal ini juga dapat disebabkan kemungkinan terjadi pada saat proses pengambilan plasmid, ketika proses pelisisan membran oleh EDTA. Kemungkinan karena kurang sempurnanya proses tersebut tidah hanya plasmid yang terambil atau terbawa, tetapi juga ikutnya DNA genom yang ukurannya lebih besar dibandingkan plasmid.

Buffer berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer,TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave. Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah. yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O (Lodish 2000). Larutan komposisi merupakan larutan campuran yang terdiri dari DNA, EcoR1, Buffer 10x, dan ddH₂O.

Simpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh, pada praktikum ini enzim memotong DNA dengan sempurna meski tidak pada semua sumur. Beberapa sumur ada yang berhasil menghasilkan 2 pita DNA, di bagian atas disebut vektor dan di bawah disebut insert. Namun ada beberapa sumur yang menghasilkan satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan praktikan dalam melakukan percobaan.

Daftar Pustaka

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000.Molecular Cell Biology. New York: Wh. Freeman Company.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.

Tjahjoleksono A. 2009. Plasmid. http://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pdf

QUANTIFIKASI DNA DAN ANALISIS KUALITAS

Nama : Devi Lia Wati

NRP : G34080061

Kelompok : 8

QUANTIFIKASI DNA DAN ANALISIS KUALITAS

Tujuan : mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA/RNA; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA

Pendahuluan

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009).

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible) (Riyadi 2009).

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).

Metode

Quantifikkasi DNA spektrofotometer

·

260

Sampel 10ml + 690ml dH₂O (kecuali sumur 4 dan 12 sampel 4ml)

· Blanko = ddH₂O

· Spektro absorban OD

280

‘OD = 50mg Absorban

Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data Hasil Spektrofotometri DNA Plasmid

kelompok	230	260	280	260/230	260/280	Konsentrasi (ng/ml)
2	0.152	0.123	0.114	0.809	1.079	1076
4	0.126	0.134	0.097	1.063	1.381	1173
6	0.133	0.048	0.041	0.361	1.171	420
10	0.150	0.162	0.119	1.08	1.361	1418
12	0.147	0.096	0.082	0.653	1.171	840
14	0.085	0.069	0.063	0.812	1.095	604
16	0.152	0.093	0.084	0.612	1.107	814
18	0.143	0.078	0.069	0.542	1.13	683
20	0.097	0.118	0.085	1.216	1.388	1033
22	0.269	0.150	0.133	0.558	1.128	1313

Keterangan : semua data tidak ada yang diatas 1.8

Pembahasan

Pada hasil uji analisis kuantitas dan kualitas DNA dengan menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa kemurnian DNA tidak mencapai hingga 100%. Hal ini karena rasio A₂₆₀/A₂₈₀ berkisar berkisar 1.07-1.38, sedangkan menurut literatur yang diperoleh kemurnaian DNA akan tercapai 100% bila rasio A₂₆₀/A₂₈₀ berkisar 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Dengan demikian kemurnain DNA hasil percobaan ini dapat dikatakan tidak berhasil karena kisaran kemurnian DNA yang dihasilkan tidak memenuhi syarat, yaitu berkisar 1.10-1.18, yang seharusnya jika DNA plasmid itu murni memiliki rasio OD₂₆₀ berbanding OD₂₈₀ lebih atau sama dengan 1,8. Kesalahan tersebut dapat disebabkan oleh kelalaian praktikan saat melakukan prosedur praktikum seperti larutan ddH₂O yang berlebihan dan selain itu dapat disebabkan oleh sedikitnya DNA karena sebagian telah terdegradasi.

Pada praktikum ini digunakan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Konsentrasi larutan menyatakan secara kuantitatif komposisi zat terlarut dan pelarut di dalam larutan. Konsentrasi umumnya dinyatakan dalam perbandingan jumlah zat terlarut dengan jumlah total zat dalam larutan, atau dalam perbandingan jumlah zat terlarut dengan jumlah pelarut. Contoh beberapa satuan konsentrasi adalah molar, molal, dan bagian per juta (part per million, ppm). Sementara itu, secara kualitatif, komposisi larutan dapat dinyatakan sebagai encer (berkonsentrasi rendah) atau pekat (berkonsentrasi tinggi) (Oxtoby 2001).

Simpulan

Percobaan ini ini meliputi pengukuran menggunakan spektrofotometer dilakukan dengan cara mengencerkan suspensi DNA plasmid dan membaca absorbansinya pada panjang gelombang 256 nm (pada umumnya 260 nm). Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni karena kisaran kemurnian DNA yang dihasilkan tidak memenuhi syarat, yaitu berkisar 1.10-1.18, seharusnya beraDa diantara 1.8-2.0.

Daftar Pustaka

Oxtoby, D.W., Gillis, H.P., Nachtrieb, N.H. (2001) Prinsip-prinsip Kimia Modern. Edisi ke-4. Jilid 1. Diterjemahkan oleh S.S. Achmadi. Jakarta: Erlangga.

Riyadi, W Riyadi, Wahyu, Macam Spektrofotometri dan Pebedaannya, Milis Kimia Indonesia, 2009.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB