Pengikut

Sabtu, 04 Juni 2011

ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSA

Nama : Devi Lia Wati

NRP : G34080061

Kelompok : 8

ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSA

Tujuan : Mengetahui dan melakukan isolasi fagmen DNA dari gel agarosa

Pendahuluan

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmenfragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Teknik elusi atau disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis merupakan tekni isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan misalnya dalam sebuah penelitian dikatakan teknik ini digunakan untuk mengisolasi protein spesifik dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006).

Analisis fragmen DNA secara tidak langsung mendeteksi perbedaan tertentu dalam urutan nukleotida molekul-molekul DNA. Dalam percobaan ini menggunakan elektroforesis gel untuk memilah bedasarkan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari molekul yang panjang dengan suatu enzim restriksi. Campuran DNA dengan enzim restriksi akan menghasilkan pita yang khas, yang menunjukkan molekul awal DNA dan enzim yang digunakan. Molekul DNA plasmid yang relatif kecil dapat diidentifikasi hanya bedasarkan fragmen-restriksi (Campbell 2002).

Metode

Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang sesuai dengan yang diinginkan, pemotongan dilakukan di atas transilluminator UV. Potongan gel dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dipotong–potong atau dicacah. Buat corong yang terbuat dari bagian eppendorf yang dasarnya telah dilubangi dan kemudian dilapisi membran nylon hybond untuk menyaring gel. Membran nylon dibasahi dengan 50 ul larutan penyangga elusi. Hasil cacahan gel dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran nylon hybond. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan melalui membran. Eppendorf disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4°C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu diekstraksi cairannya dengan PCI sebanyak 1x volume supernatan. Larutan divorteks selama 1 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. supernatan (fase atas dari hasil sentrifugasi) diambil, lalu larutan diendapkan dengan menambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M, pH 5 dan 23 volume etanol absolut). Pelet yang dihasilkan dibilas dengan etanol 70% lalu dikeringkan dengan vakum. Endapan disuspensikan dengan menambahkan 15 – 20 ul dH20.

Hasil Pengamatan

Elusi atas

Elusi bawah

Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan setelah dilakukan running pada elektroforesis pada fragmen DNA maka didapatkan data berupa gambar, hasil yang diperoleh menunjukkan semua kelompok hampir tidak mendapatkan hasil DNA, kecuali satu kelompok yang terdapat pita. Pita DNA itu terlihat tipis. Hal tersebut mungkin disebabkan kontaminasi akibat dari kurang sterilnya saat pengerjaan atau praktikan kurang teliti dalam melakukan rangkaian percobaan sehingga DNA plasmid tertinggal dan tidak terambil. Selain itu juga dapat disebabkan terlalu banyaknya gel yang terpotong ataupun banyak DNA dari vektor yang rusak akibat terlalu lama terkena sinar UV keika akan dipotong. Hal ini dapat diatasi dengan meminimalkan waktu pemotongan di atas transuliminator dan juga kuantitas gel dikurangi agar ketika dielusi dengan bufer, banyak dari gen yang ikut terelusi.

Keberadaan plasmid DNA dilihat dari sumur-sumur gel yang menghasilkan pita pada saat running. Kegunaan larutan penyangga atau buffer elusi adalah untuk melicinkan DNA saat di saring pada tabung ependorf, penambahan etanol Na asetat bermuatan positif berfungsi untuk mengikat molekul DNA yang bermuatan negatif. Setelah diikat dengan etanol dilakukan inkubasi dan sentrifuse untuk memisahkan larutan dengan DNA. Etanol absolute berfungsi untuk mengendapkan DNA.

Fragmen DNA yang diisolasi dengan teknik ini dalam praktikum yang dilakukan yaitu fragmen DNA yang didapat dari hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi pada praktikum sebelumnya. Senyawa yang digunakan dalam praktikum ini yaitu berupa larutan penyangga elusi yang terdiri dari Tris pH 7.5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), H2O atau TE. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al 1995). SDS merupakan suatu detergen fungsinya yaitu membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991). Membran nylon hybond untuk menyaring gel.

Simpulan

Percobaan ini dapat dikatakan kurang berhasil karena sebagian besar kelompok tidak memperoleh pita DNA setelah dilakukan running. Kesalahan tersebut diakibatkan oleh praktikan yang kurang teliti dalam melakukan tahapan-tahapan percobaan yang mana dituntut bekerja dengan ketelitian tinggi serta steril. Karena bekerja dengan sesuatu yang berukuran mikro.

Daftar Pustaka

Brown, T.A. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.

Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Fitriyah Juliani. 2006. Isolasi protein spesifik intestine cacing Mecistocirrus digitatus dewasa dengan teknik elusi. [Skripsi]. Surabaya: UNAIR Press

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books.

Tidak ada komentar: