Nama : Devi Lia Wati
NRP : G34080061
Kelompok : 8
PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI
Tujuan : mengetahui dan melakukan pemotongan DNA dengan enzin Restriksi
Pendahuluan
Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda.
Enzim restriksi endonuklease mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme (Sambrook 1989).
Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda. Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca dengan arah yang sama. Sekuen ini disebut palindromik. Berdasarkan ujung hasil pemotongannya, enzim restriksi dapat memotong dengan ujung lengket/lancip (sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end). Enzim yang memotong pada kedua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI. Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI,MspI dan lain-lain (Stansfield 2003)
Metode
Elektroforesis (gel agarose)
Hasil
Pembahasan
Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends ataucohesive ends (Tjahjoleksono 2009).
Setelah dilakukan restriksi untuk memotong gen dan vektor agar mempunyai ujung yang spesifik, dilakukanlah elektroforesis agar gen atau vektor yang diperoleh dapat diisolasi yang akan digunakan dalam proses ligasi. Gambar 1 adalah hasil dari elektroforesis proses restriksi yang nantinya pita tersebut akan dipotong untuk isolasi fragmen. Berdasarkan hasil yang di dapat terlihat ada dua pita yang terbentuk, satu pita berada diatas dan satu pita berada di bawah. Pita yang beada diatas disebut vector karena ukurannya lebih besar dan yang di bawah disebut insert, hal itu terjadi karena adanya perbedaan berat diantara vektor dan insert. Namun dalam foto terlihat ada beberapa sumur yang hanya memiliki satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan teknis yang dilakukan praktikan. Hal ini juga dapat disebabkan kemungkinan terjadi pada saat proses pengambilan plasmid, ketika proses pelisisan membran oleh EDTA. Kemungkinan karena kurang sempurnanya proses tersebut tidah hanya plasmid yang terambil atau terbawa, tetapi juga ikutnya DNA genom yang ukurannya lebih besar dibandingkan plasmid.
Buffer berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer,TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave. Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah. yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O (Lodish 2000). Larutan komposisi merupakan larutan campuran yang terdiri dari DNA, EcoR1, Buffer 10x, dan ddH2O.
Simpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh, pada praktikum ini enzim memotong DNA dengan sempurna meski tidak pada semua sumur. Beberapa sumur ada yang berhasil menghasilkan 2 pita DNA, di bagian atas disebut vektor dan di bawah disebut insert. Namun ada beberapa sumur yang menghasilkan satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan praktikan dalam melakukan percobaan.
Daftar Pustaka
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000.Molecular Cell Biology. New York: Wh. Freeman Company.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.
Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.
Tjahjoleksono A. 2009. Plasmid. http://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pdf
Tidak ada komentar:
Posting Komentar