QUANTIFIKASI DNA DAN ANALISIS KUALITAS

Nama : Devi Lia Wati

NRP : G34080061

Kelompok : 8

QUANTIFIKASI DNA DAN ANALISIS KUALITAS

Tujuan : mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA/RNA; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA

Pendahuluan

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009).

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible) (Riyadi 2009).

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).

Metode

Quantifikkasi DNA spektrofotometer

·

260

Sampel 10ml + 690ml dH₂O (kecuali sumur 4 dan 12 sampel 4ml)

· Blanko = ddH₂O

· Spektro absorban OD

280

‘OD = 50mg Absorban

Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data Hasil Spektrofotometri DNA Plasmid

kelompok	230	260	280	260/230	260/280	Konsentrasi (ng/ml)
2	0.152	0.123	0.114	0.809	1.079	1076
4	0.126	0.134	0.097	1.063	1.381	1173
6	0.133	0.048	0.041	0.361	1.171	420
10	0.150	0.162	0.119	1.08	1.361	1418
12	0.147	0.096	0.082	0.653	1.171	840
14	0.085	0.069	0.063	0.812	1.095	604
16	0.152	0.093	0.084	0.612	1.107	814
18	0.143	0.078	0.069	0.542	1.13	683
20	0.097	0.118	0.085	1.216	1.388	1033
22	0.269	0.150	0.133	0.558	1.128	1313

Keterangan : semua data tidak ada yang diatas 1.8

Pembahasan

Pada hasil uji analisis kuantitas dan kualitas DNA dengan menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa kemurnian DNA tidak mencapai hingga 100%. Hal ini karena rasio A₂₆₀/A₂₈₀ berkisar berkisar 1.07-1.38, sedangkan menurut literatur yang diperoleh kemurnaian DNA akan tercapai 100% bila rasio A₂₆₀/A₂₈₀ berkisar 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Dengan demikian kemurnain DNA hasil percobaan ini dapat dikatakan tidak berhasil karena kisaran kemurnian DNA yang dihasilkan tidak memenuhi syarat, yaitu berkisar 1.10-1.18, yang seharusnya jika DNA plasmid itu murni memiliki rasio OD₂₆₀ berbanding OD₂₈₀ lebih atau sama dengan 1,8. Kesalahan tersebut dapat disebabkan oleh kelalaian praktikan saat melakukan prosedur praktikum seperti larutan ddH₂O yang berlebihan dan selain itu dapat disebabkan oleh sedikitnya DNA karena sebagian telah terdegradasi.

Pada praktikum ini digunakan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Konsentrasi larutan menyatakan secara kuantitatif komposisi zat terlarut dan pelarut di dalam larutan. Konsentrasi umumnya dinyatakan dalam perbandingan jumlah zat terlarut dengan jumlah total zat dalam larutan, atau dalam perbandingan jumlah zat terlarut dengan jumlah pelarut. Contoh beberapa satuan konsentrasi adalah molar, molal, dan bagian per juta (part per million, ppm). Sementara itu, secara kualitatif, komposisi larutan dapat dinyatakan sebagai encer (berkonsentrasi rendah) atau pekat (berkonsentrasi tinggi) (Oxtoby 2001).

Simpulan

Percobaan ini ini meliputi pengukuran menggunakan spektrofotometer dilakukan dengan cara mengencerkan suspensi DNA plasmid dan membaca absorbansinya pada panjang gelombang 256 nm (pada umumnya 260 nm). Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni karena kisaran kemurnian DNA yang dihasilkan tidak memenuhi syarat, yaitu berkisar 1.10-1.18, seharusnya beraDa diantara 1.8-2.0.

Daftar Pustaka

Oxtoby, D.W., Gillis, H.P., Nachtrieb, N.H. (2001) Prinsip-prinsip Kimia Modern. Edisi ke-4. Jilid 1. Diterjemahkan oleh S.S. Achmadi. Jakarta: Erlangga.

Riyadi, W Riyadi, Wahyu, Macam Spektrofotometri dan Pebedaannya, Milis Kimia Indonesia, 2009.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB